某种SARS的循环蝙蝠冠状病毒簇显示了人类出现的潜力-胜祥之道

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某种SARS的循环蝙蝠冠状病毒簇显示了人类出现的潜力

作者:Vineet D Menachery，等时间:2020-02-04 23:59:25 浏览:1897 来源:网络

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某种SARS的循环蝙蝠冠状病毒簇显示了人类出现的潜力

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· 发布时间： 2015年11月9日

类似于SARS的循环蝙蝠冠状病毒簇显示了人类出现的潜力

《自然医学》 第 21 卷，第1508至 1513 页（ 2015）引用本文

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严重急性呼吸系统综合症冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸系统综合症（MERS）-CoV的出现突显了跨物种传播事件的威胁，导致人类暴发。在这里，我们研究了SARS样病毒SHC014-CoV的潜在疾病，该病毒目前正在中国的马蹄蝠种群中传播¹。使用SARS-CoV反向遗传学系统²，我们产生并鉴定了一种在小鼠适应性SARS-CoV主链中表达蝙蝠冠状病毒SHC014的峰值的嵌合病毒。结果表明，在野生型主链中编码SHC014刺突的2b组病毒可以有效利用SARS受体人类血管紧张素转化酶II（ACE2）的多个直系同源物，在原代人气道细胞中有效复制，并达到与流行病相当的体外滴度SARS-CoV株。此外，体内实验证明嵌合病毒在小鼠肺中的复制具有明显的发病机理。对现有的基于SARS的免疫治疗和预防方式的评估显示疗效差；单克隆抗体和疫苗方法均无法使用新型刺突蛋白中和并不能防止CoV感染。在这些发现的基础上，我们合成了感染性全长SHC014重组病毒，并在体外和体内证明了强大的病毒复制能力。我们的工作表明，蝙蝠种群中目前流行的病毒可能会再次出现SARS-CoV的潜在风险。

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主要

SARS冠状病毒的出现与全球化导致世界各地的迅速蔓延和大规模经济影响严重的呼吸系统疾病的跨物种传播预示着一个新时代的³^，⁴。此后，从动物种群中出现了几株病毒，包括甲型流感病毒H5N1，H1N1和H7N9以及MERS-CoV，给受灾地区造成相当大的疾病，死亡率和经济困难⁵。虽然公共卫生措施能阻止SARS病毒爆发⁴，最近宏基因组学的研究有密切相关的SARS样病毒在中国的蝙蝠种群循环，可能造成未来的威胁识别序列¹^，⁶。但是，仅序列数据就无法识别和准备未来的大流行前病毒。因此，为了检查循环蝙蝠冠状病毒的出现潜力（即感染人类的潜力），我们从中国马蹄蝠¹分离的RsSHC014-CoV序列中构建了一种编码新型，人畜共患的冠状病毒刺突蛋白的嵌合病毒。-在适应SARS-CoV小鼠的骨架中。杂交病毒使我们能够评估新型刺突蛋白与自然骨架中其他必要的适应性突变无关的引起疾病的能力。使用这种方法，我们表征了原代人气道细胞和体内 SHC014突触蛋白介导的冠状病毒感染，并测试了针对SHC014-CoV的可用免疫疗法的功效。该策略共同转换了宏基因组学数据，以帮助预测并为将来出现的病毒做好准备。

SHC014和相关的RsWIV1-CoV的序列表明，这些CoV与流行SARS-CoV毒株最接近（图1a，b）。但是，结合人ACE2（SARS-CoV的受体）的14个残基存在重要差异，其中包括对宿主范围至关重要的5个残基：Y442，L472，N479，T487和Y491（参考文献7）。在WIV1中，这些残基中的三个与流行的SARS-CoV Urbani菌株不同，但预计它们不会改变与ACE2的结合（补充图1a，b和补充表1）。这两个假冒实验均证实了这一事实，该实验测量了编码WIV1穗突蛋白的慢病毒进入表达人ACE2的细胞的能力（补充图1）。）和WIV1-CoV的体外复制测定（参考资料1）。相反，SHC014中14个ACE2相互作用残基中的7个与SARS-CoV中的残基不同，包括对宿主范围至关重要的所有5个残基（补充图1c和补充表1）。这些变化，再加上表达SHC014穗的假型慢病毒无法进入细胞（补充图1d），表明SHC014穗不能与人ACE2结合。然而，在相关的SARS冠状病毒毒株相似的变化已报告允许ACE2结合⁷^，⁸，表明需要进行其他功能测试才能进行验证。因此，我们在具有复制能力的小鼠适应性SARS-CoV主链（以下将嵌合CoV称为SHC014-MA15）的背景下合成了SHC014峰，以最大程度地在小鼠中进行发病机理和疫苗研究（补充图） 2a）。尽管基于结构的建模和假型实验都做出了预测，但SHC014-MA15还是可行的，并在Vero细胞中复制至高滴度（补充图2b）。与SARS相似，SHC014-MA15也需要功能性ACE2分子才能进入，并且可以使用人类，灵猫和蝙蝠ACE2直系同源物（补充图2c，d）。为了测试SHC014尖峰介导人气道感染的能力，我们检查了人上皮气道细胞系Calu-3 2B4（参考文献9）对感染的敏感性，并发现了SHC014-MA15的强大复制能力，与SHC014-MA15的复制能力相当。 SARS-CoV Urbani（图1c）。为了扩展这些发现，人类主要气道上皮（HAE）培养物被感染并显示出两种病毒的强力复制（图1d）。总之，这些数据证实了带有SHC014刺突的病毒感染人类气道细胞的能力，并强调了SHC014-CoV跨物种传播的潜在威胁。

图1：SARS样病毒在人气道细胞中复制并产生体内发病机理。

（a）如在线方法中所述，对代表性CoV的全长基因组序列进行比对和系统发育定位。比例尺代表核苷酸取代，只有高于70％的自举支持被标记。该树显示CoV分为三个不同的系统发育组，分别定义为α-CoV，β-CoV和γ-CoV。对于β-CoV，经典子群群集标记为2a，2b，2c和2d，对于α-CoV，标记为1a和1b。（b）2b组的代表性β-CoV的尖峰的S1结构域的氨基酸序列，包括SARS-CoV，进行了比对并进行了系统发育定位。比例尺代表氨基酸取代。（c，d在感染了Calu-3 2B4细胞（c）或分化良好的原初气液界面HAE细胞培养物（d）之后，SARS-CoV Urbani（黑色）和SHC014-MA15（绿色）的病毒复制两种细胞类型的（MOI）为0.01。在单个时间点收集样品，进行Calu-3和HAE实验的生物学重复（n = 3）。（e，f）体重减轻（SARS-CoV MA15为n = 9；SHC014-MA15为n = 16）（e）和肺部病毒复制（SARS-CoV MA15为n = 3；SHC014 - n为n = 4 MA15）（f）经鼻内（in）途径感染了1×10 ⁴ pfu小鼠适应性SARS-CoV MA15（黑色）或SHC014-MA15（绿色）的10周龄BALB / c小鼠。（g，h）显示了来自SARS-CoV MA15（n = 3小鼠）（g）或SHC014-MA15（n = 4小鼠）（h）感染的小鼠的SARS-CoV N抗原染色的肺切片的代表性图像。对于每张图，中心值代表组平均值，误差线定义sem比例尺，1 mm。

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为了评估SHC014峰值在体内介导感染中的作用，我们用10 ⁴^个斑块形成单位（pfu）的SARS-MA15或SHC014-MA15 感染了10周龄的BALB / c小鼠（图1e–h）。感染SARS-MA15的动物在感染后4 d（dpi）出现快速的体重减轻和致死率；相比之下，SHC014-MA15感染在小鼠中产生了明显的体重减轻（10％），但没有致死性（图1e）。病毒复制的检查显示，感染SARS-MA15或SHC014-MA15的小鼠肺部病毒滴度几乎相等（图1f）。而感染SARS-MA15的小鼠的肺在细支气管末梢和肺实质中均显示强力染色（2 dpi）（图1g）。），被SHC014-MA15感染的小鼠的气道抗原染色减少（图1h）；相反，在薄壁组织或整个组织学评分中未观察到抗原染色的缺陷，表明SHC014-MA15的肺组织有差异性感染（补充表2）。接下来，我们分析了更易感的老年（12个月大）动物的感染情况。受SARS-MA15感染的动物体重迅速减轻并屈服于感染（补充图3a，b）。SHC014-MA15感染可引起稳健且持续的体重减轻，但致死率极低。我们在年幼的小鼠中观察到的组织学和抗原染色模式的趋势在年长的动物中得以保留（补充表3））。根据使用Ace2 ^-/-小鼠的实验，我们排除了SHC014-MA15通过替代受体介导感染的可能性，该实验在SHC014-MA15感染后未显示体重减轻或抗原染色（补充图4a，b和补充表2）。总之，数据表明具有SHC014刺突的病毒能够在有毒的CoV主链背景下诱导小鼠体重减轻。

考虑到埃博拉单克隆抗体疗法（例如ZMApp ^10）的临床前功效，我们接下来试图确定SARS-CoV单克隆抗体对抗SHC014-MA15感染的功效。四广泛中和针对SARS冠状病毒刺突蛋白已经被先前报道，并且是免疫试剂可能人类单克隆抗体¹¹^，¹²^，¹³。我们检查了这些抗体对病毒复制的影响（表示为病毒复制的抑制百分比），发现野生型SARS-CoV Urbani在相对较低的抗体浓度下被所有四种抗体强烈中和（图2a–d），SHC014-MA15的中和效果有所不同。FM6，通过噬菌体展示产生的和逃避突变型的抗体¹¹^，¹²，仅实现抑制SHC014-MA15复制（的背景水平图2a）。同样，源自SARS-CoV感染患者^13的记忆B细胞的抗体230.15和227.14 也未能阻止SHC014-MA15复制（图2b，c）。对于所有三种抗体，SARS和SHC014尖峰氨基酸序列之间的差异对应于SARS-CoV逃逸突变体（fm6 N479R; 230.15 L443V; 227.14 K390Q / E）中发现的直接或相邻残基变化，这可能解释了抗体的缺失针对SHC014的中和活性。最后，单克隆抗体109.8能够实现SHC014-MA15的50％中和，但仅在高浓度（10μg/ ml）时（图2d）。总之，结果表明，针对SARS-CoV的广泛中和抗体可能仅对新兴SARS样CoV菌株（如SHC014）具有边际功效。

图2：SARS-CoV单克隆抗体对SARS样CoV的疗效有限。

（a – d）中和测定法评估一组最初针对流行性SARS-CoV产生的单克隆抗体对SARS-CoV Urbani感染Vero细胞的功效（黑色斑块的减少）（以黑色表示）或SHC014-MA15（绿色）。测试的抗体是FM6（Ñ = 3厄巴尼; ñ = 5 SHC014-MA15）¹¹^，¹²（一），230.15（Ñ = 3厄巴尼; ñ为SHC014-MA15 = 2）（b），227.15（Ñ对于Urbani = 3; 对于SHC014-MA15 ，n = 5（c）和109.8（n对于Urbani = 3；对于SHC014-MA15）¹³（d）n = 2 。每个数据点代表组均值，误差线定义sem。请注意，b，c中SARS-CoV Urbani感染的Vero细胞中的误差线与符号重叠，因此不可见。

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为了评估现有疫苗抵抗SHC014-MA15感染的功效，我们用双重灭活的完整SARS-CoV（DIV）疫苗接种了老年小鼠。先前的工作表明DIV可以中和并保护年轻小鼠免受同源病毒的攻击¹⁴ ; 然而，该疫苗未能保护其中还观察到增强的免疫病理的老年动物，这表明由于疫苗接种¹⁵，动物受到了伤害。在这里，我们发现DIV不能在体重减轻或病毒滴度方面为SHC014-MA15的攻击提供保护（补充图5a，b）。与其他异源2b组CoV的先前报告一致¹⁵此外，来自接种DIV的老年小鼠的血清也未能中和SHC014-MA15（补充图5c）。值得注意的是，DIV疫苗接种导致了强大的免疫病理（补充表4）和嗜酸性粒细胞增多（补充图5d–f）。在一起，这些结果证实DIV疫苗不能预防SHC014感染，并且可能增加老年接种组的疾病。

与DIV小鼠疫苗接种相反，将SHC014-MA15用作减毒活疫苗显示出针对SARS-CoV攻击的潜在交叉保护作用，但结果有重要警告。我们用10 ⁴ pfu的SHC014-MA15 感染了幼鼠，并观察了28天。然后，我们在第29天用SARS-MA15攻击了小鼠（补充图6a）。尽管在SHC014-MA15感染后28 d产生的抗血清只有极少的SARS-CoV中和反应，但先前用高剂量SHC014-MA15感染的小鼠可防御致命剂量的SARS-MA15攻击（补充图6b，1：200）。在没有二级抗原升压的，28 dpi的表示的抗体滴度的预期峰值和意味着有将随时间而减少针对SARS-CoV的保护¹⁶^，¹⁷。在体重减轻和病毒复制方面，在衰老的BALB / c小鼠中观察到了类似的结果，表明用致死剂量的SARS-CoV攻击具有保护作用（补充图6c，d）。然而，在某些老年动物中，SHC014-MA15感染剂量为10 ⁴ pfu导致体重减轻和致死率> 10％（图1和补充图3）。）。我们发现，以较低剂量的SHC014-MA15（100 pfu）进行疫苗接种不会诱导体重减轻，但也无法保护老年动物免受SARS-MA15致命剂量的攻击（补充图6e，f）。总之，数据表明，SHC014-MA15攻击可能通过保守的表位赋予针对SARS-CoV的交叉保护作用，但所需剂量可诱发发病机理，并不能用作减毒疫苗。

确定SHC014尖峰具有介导人类细胞感染并引起小鼠疾病的能力后，我们接下来基于用于SARS-CoV的方法合成了全长SHC014-CoV感染性克隆（图3a）²。在Vero细胞中复制显示SHC014-CoV相对于SARS-CoV没有缺陷（图3b）；然而，在感染后24小时和48小时，原代HAE培养物中SHC014-CoV显着降低（P <0.01）（图3c）。与SARS-CoV Urbani相比，小鼠的体内感染没有显示出明显的体重减轻，但在全长SHC014-CoV感染的肺部显示出病毒复制减少（图3d，e）。总之，这些结果确定了全长SHC014-CoV的生存力，但表明其复制必须与人类呼吸道细胞和小鼠中流行的SARS-CoV的复制相一致，需要进一步的适应。

图3：全长SHC014-CoV在人呼吸道中复制，但缺乏流行性SARS-CoV的毒力。

（a）SHC014-CoV分子克隆的示意图，该克隆被合成为六个连续的cDNA（命名为SHC014A，SHC014B，SHC014C，SHC014D，SHC014E和SHC014F），两侧是独特的BglI位点，可以定向组装表达全长cDNA的cDNA开放阅读框（1a，1b，尖峰，3，包膜，基质，6-8和核衣壳）。带下划线的核苷酸代表限制性内切酶切割后形成的突出端序列。（b，c）感染Vero细胞（b）或分化良好的主要气液界面HAE细胞培养物后，SARS-CoV Urbani（黑色）或SHC014-CoV（绿色）的病毒复制（c）的MOI为0.01。每组在各个时间点采集样品，进行生物学重复（n = 3）。数据代表Vero和HAE细胞的一项实验。（d，ê）重量损失（Ñ = 3 SARS-CoV的MA15，Ñ = 7 SHC014-CoV的; ñ = 6 SARS-厄巴尼）（d）和病毒复制在肺部（Ñ = 3 SARS-厄巴尼和SHC014冠状病毒）（Ë感染1×10 10周龄BALB / c小鼠的）⁵，SHC014冠状病毒（绿色）或SARS-CoV的厄巴尼（黑色）通过SARS-CoV病毒pfu的MA15（灰色）在途中。每个数据点代表组均值，误差线定义sem **使用个别时间点的两尾学生t检验，P <0.01和*** P <0.001 。

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在SARS冠状病毒流行期间，人们很快发现了棕榈ive与人类中发现的冠状病毒株之间的联系⁴。基于这一发现，常见的出现范式认为，流行性SARS-CoV起源于蝙蝠病毒，跃迁至小窝并在受体结合域（RBD）内引入了变化，以改善与麝猫Ace2的结合（参考文献18）。随后暴露于活畜市场中的人们，使人类感染了麝香毒株，而该麝香毒株又适合成为流行毒株（图4a）。但是，系统发育分析表明，早期人类SARS菌株与蝙蝠菌株的关系似乎比灵猫菌株更为紧密[ ^18]。。因此，第二种观点认为蝙蝠直接传播是SARS-CoV的出现，而棕榈科动物则是继发宿主和持续感染的宿主（图4b）¹⁹。对于这两种范例，都认为必须在次要宿主中适应峰值，大多数突变预计会发生在RBD内，从而有助于改善感染。两种理论都暗示蝙蝠冠状病毒的库是有限的，宿主范围的突变既是随机的又是罕见的，从而降低了人类未来出现突发事件的可能性。

图4：冠状病毒的出现范例。

冠状病毒株保持在蝙蝠种群中循环的准物种库中。（a，b）传统的SARS冠状病毒出现理论认为，寄主范围的突变体（红色圆圈）代表随机和罕见的事件，允许感染替代宿主。次生宿主范式（a）认为，非人类宿主被蝙蝠祖细胞病毒感染，并通过适应促进向人类的传播；随后在人体内的复制导致流行性病毒株。直接范式（b）提示，蝙蝠与人之间可发生传播，而无需中间宿主；然后在人群中进行选择，并在次要宿主中复制密切相关的病毒，从而使病毒持续存在并在两者中都具有适应性。（c）来自类似SARS的嵌合病毒的数据表明，准物种库中存在多种能够感染人类细胞而无需突变的病毒（红色圆圈）。尽管流行病可能需要适应继发宿主或人类宿主，但如果含有SHC014穗的病毒与强毒的CoV主链（带有绿色轮廓的圆圈）重组，那么人类可能会导致流行病。现有数据支持所有这三种范式。

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尽管我们的研究并未使其他出现途径无效，但它确实提出了第三种范式，即循环蝙蝠CoV池保持“平衡”的刺突蛋白，能够感染人类而无突变或不适应（图4c）。通过SARS-CoV主链中包含SHC014刺突的嵌合病毒在人气道培养物中和未适应RBD的小鼠中引起强烈感染的能力可以说明这一假设。加上以前鉴定的致病冠状病毒主链的观察³^，²⁰，我们的研究结果表明，SARS样紧急菌株所需的原材料目前正在动物水库中流通。值得注意的是，尽管全长SHC014-CoV可能需要额外的骨架适应性来介导人类疾病，但有记录的CoV家族中的高频重组事件强调了未来出现的可能性和进一步准备的必要性。

迄今为止，动物种群的基因组学筛选已主要用于鉴定暴发环境中的新型病毒²¹。这里的方法将这些数据集扩展为检查病毒出现和治疗功效的问题。我们认为具有SHC014尖峰的病毒由于其在原代人类气道培养物中复制的能力而成为潜在的威胁，这是人类疾病的最佳模型。另外，在小鼠中观察到的发病机制表明含有SHC014的病毒能够在没有RBD适应的情况下在哺乳动物模型中引起疾病。值得注意的是，相对于SARS-CoV Urbani，与SARS-MA15相比，肺中的向异性和HAE培养物中全长SHC014-CoV的衰减相对于SARS-CoV Urbani而言，提示了ACE2结合以外的因素-包括穗突性，受体生物利用度或拮抗作用宿主免疫反应中的一部分可能有助于出现。然而，需要对非人类灵长类动物进行进一步测试，以将这些发现转化为人类致病潜能。重要的是，现有治疗方法的失败定义了进一步研究和开发治疗方法的关键需求。有了这些知识，就可以制作监视程序，诊断试剂和有效的治疗方法，以防止出现第2b组特异的CoV，例如SHC014，并将这些方法应用于维护相似异质库的其他CoV分支。

除了为将来的新兴病毒提供准备外，还必须在美国政府强制暂停功能获得（GOF）研究的背景下考虑采用这种方法²²。在以前出现的模型的基础上（图4a，b），预计不会产生嵌合病毒（例如SHC014-MA15）会增加致病性。尽管SHC014-MA15相对于其亲本小鼠适应的SARS-CoV减毒，但类似的研究检查了MA15骨架内野生型Urbani尖峰的CoV的致病性，显示小鼠无体重减轻和病毒复制减少²³。因此，相对于Urbani峰值–MA15 CoV，SHC014-MA15的发病机理有所改善（图1）。）。基于这些发现，科学审查小组可能认为类似的研究基于无法冒险进行的循环株构建嵌合病毒，因为不能排除哺乳动物模型中致病性的增加。再加上对小鼠适应株的限制以及使用逃逸突变体开发单克隆抗体的方法，对CoV出现和治疗功效的研究可能会严重受限。这些数据和限制一起代表了GOF研究关注的十字路口；必须权衡准备和缓解未来爆发的潜力与创造更多危险病原体的风险。在制定前进的政策时，

总体而言，我们的方法已使用宏基因组学数据来识别由循环蝙蝠SARS状CoV SHC014构成的潜在威胁。由于嵌合的SHC014病毒在人气道培养物中复制的能力，在体内引起发病机理并逃脱当前的治疗方法，因此需要针对循环的SARS样病毒的监视和改进的治疗方法。我们的方法还可以利用宏基因组学数据来预测病毒的出现，并将这些知识应用于准备治疗未来出现的病毒感染。

方法

病毒，细胞，体外感染和噬菌斑测定。

将野生型SARS-CoV（Urbani），适应小鼠的SARS-CoV（MA15）和嵌合型SARS样CoV培养在Vero E6细胞上（从美国陆军传染病研究所获得），该细胞在Dulbecco改良的Eagle's培养基上生长。培养基（DMEM）（Gibco，CA）和5％胎儿克隆血清（FCS）（Hyclone，South Logan，UT）以及抗生素/抗真菌药（Gibco，Carlsbad，CA）。表达ACE2直向同源物的DBT细胞（Baric实验室，来源未知）先前已被描述为人类和麝猫。球棒的Ace2序列是基于从菊头蝠，并表达蝙蝠DBT细胞的Ace2如前所述建立⁸。伪型实验与使用基于HIV的伪病毒的实验类似，如先前所述¹⁰制备，并在表达ACE2直系同源物的HeLa细胞（武汉病毒学院）上进行了检查。HeLa细胞在最低必需培养基补充有10个％FCS（Gibco公司，CA）如先前所述（MEM）（Gibco公司，CA）中生长²⁴。如先前所述进行在Vero E6，DBT，将Calu-3和2B4原代人呼吸道上皮细胞的生长曲线⁸^，²⁵。尽管用于创建工作储备库的原始种子库没有受到污染，但最近尚未对任何工作细胞系储备库进行支原体鉴定或测试。用于HAE培养的人肺是在北卡罗来纳大学教堂山机构审查委员会批准的规程下采购的。HAE培养物代表高度分化的人气道上皮，其中包含纤毛和非纤毛上皮细胞以及杯状细胞。如前所述，培养物还应在气液界面上生长数周，如前所述²⁶。简而言之，将细胞用PBS洗涤，并用病毒接种或在PBS中于37℃模拟稀释40分钟。接种后，将细胞洗涤3次，并加入新鲜培养基以表示时间“ 0”。在每个所述的时间点收获三个或三个以上的生物重复样本。没有在任何样品收集中使用盲法，也没有将样品随机化。所有病毒的培养均在生物安全级（BSL）3实验室中进行，而生物安全柜中则装有冗余风扇，如我们之前的小组^2所述。所有人员都穿着带有特卫强防护服，围裙和赃物的电动空气净化呼吸器（Breathe Easy，3M），并戴了双手套。

序列聚类和结构建模。

从Genbank或Pathosystems资源整合中心（PATRIC）下载具有代表性的CoV穗的S1结构域的全长基因组序列和氨基酸序列，与ClustalX进行比对，并通过系统分析使用100个自举法或使用PhyML（https://code.google.com/p/phyml/）封装。该树是使用PhyML软件包使用最大可能性生成的。比例尺代表核苷酸取代。仅标记引导程序支持高于70％的节点。该树显示CoV分为三个不同的系统发生组，分别定义为α-CoV，β-CoV和γ-CoV。对于β-CoV，经典子组群集标记为2a，2b，2c和2d，对于α-CoV，标记为1a和1b。使用Modeller（马克斯普朗克研究所生物信息学工具包）生成结构模型，以基于晶体结构2AJF（蛋白质数据库）生成SARS RBD的SHC014和Rs3367与ACE2的同源性模型。在MacPyMol（1.3版）中可视化和操作同源模型。

SARS样嵌合病毒的构建。

如前所述，野生型和嵌合病毒均来自SARS-CoV Urbani或相应的小鼠适应性（SARS-CoV MA15）感染性克隆（ic）²⁷。通过限制性消化提取含有SHC014刺突序列的质粒，并连接到MA15感染性克隆的E和F质粒中。设计该克隆并从Bio Basic购买六种连续cDNA，并使用侧接独特的II类限制性核酸内切酶位点（BglI）的公开序列。之后，扩增，切除，连接和纯化含有野生型，嵌合SARS-CoV和SHC014-CoV基因组片段的质粒。然后进行体外转录反应以合成全长基因组RNA，如先前所述将其转染到Vero E6细胞中²。收获转染细胞的培养基，并用作后续实验的种子库。在用于这些研究之前，通过序列分析证实了嵌合和全长病毒。嵌合突变体和全长SHC014-CoV的合成构建得到北卡罗莱纳大学机构生物安全委员会和关注双重用途研究委员会的批准。

伦理声明。

这项研究是根据NIH实验动物福利办公室（OLAW）关于动物护理和使用的建议进行的。北卡罗莱纳大学教堂山分校的动物保护与使用委员会（IACUC）批准了这些研究中使用的动物研究方案（IACUC＃13-033）（UNC，许可证编号A-3410-01）。

小鼠和体内感染。

从Harlan Laboratories订购了雌性，10周龄和12个月大的BALB / cAnNHsD小鼠。如先前所述进行小鼠感染²⁰。简要地，将动物带入BSL3实验室，并使其在感染前适应1周。对于感染和减毒活疫苗接种，将小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物麻醉，并在鼻腔感染时用50μl磷酸盐缓冲液（PBS）或稀释的病毒经鼻内感染，每个时间点每只三或四只小鼠，感染组每剂量如附图说明中所述。对于个别小鼠，研究人员可以酌情决定是否将小鼠数据排除在外，包括不吸入全部剂量，鼻腔冒泡或通过口部感染引起的感染。感染后，没有定义其他预先建立的排除或纳入标准。在任何动物实验中均未使用盲法，且动物未随机分组。接种疫苗通过足垫注射为年轻和老年小鼠接种20μl的含明矾或模拟PBS的0.2μg双灭活SARS-CoV疫苗；然后在22天后以相同的方案对小鼠进行加强免疫，然后在21天后进行攻击。对于所有组，按照实验方案，在实验过程中每天监测动物的疾病临床体征（弯曲，毛皮松动和活动减少）。每天在头7天监测体重减轻，此后继续进行体重监测，直到动物恢复至初始初始体重或连续3天显示体重增加为止。所有体重下降超过其初始体重20％的小鼠都被喂食，并每天监测多次，只要它们处于20％的临界值以下即可。按照实验方案，立即将体重减轻超过起始体重30％的小鼠处死。根据研究人员的判断，任何被认为垂死或不太可能恢复的小鼠也被人道地处死。安乐死使用过量的异氟烷进行，通过颈脱位证实死亡。使用UNC机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案，在北卡罗来纳大学进行了所有小鼠研究（动物福利保证＃A3410-01）。

组织学分析。

取出左肺，浸没在10％福尔马林缓冲液（Fisher）中，不充气1周。将组织包埋在石蜡中，并由UNC Lineberger综合癌症中心组织病理学核心设施制备5μm切片。为了确定抗原染色的程度，使用市售的多克隆SARS-CoV抗核衣壳抗体（Imgenex）对切片进行病毒抗原染色，并如前所述以盲法方式对气道和实质进行染色²⁰。使用带有Olympus DP71相机的Olympus BX41显微镜捕获图像。

病毒中和测定。

噬斑减少中和效价测定法与先前表征针对SARS-CoV的抗体进行，如前所述¹¹^，¹²^，¹³。简而言之，将中和抗体或血清进行两次连续稀释，并与100 pfu的不同感染性克隆SARS-CoV菌株在37°C孵育1小时。然后将病毒和抗体以5×10 ⁵ Vero E6细胞/孔添加到6孔板中，并重复多次（n≥2）。在37°C下孵育1小时后，在培养基中铺上3 ml 0.8％琼脂糖。将板在37℃下孵育2天，用中性红染色3小时并计数噬菌斑。计算噬菌斑减少的百分比为（1-（（带有抗体的噬菌斑数量/没有抗体的噬菌斑数量））×100。

统计分析。

所有实验均与两个实验组（两种病毒，或已接种和未接种的队列）进行对比。因此，病毒滴度和组织学评分的显着差异是通过在各个时间点进行的两尾Student t检验确定的。数据以正态分布在每个要比较的组中，并具有相似的方差。

生物安全和生物安全。

在北卡罗莱纳大学机构生物安全委员会批准实验方案后启动了报道的研究（项目名称：蝙蝠SARS样CoV的感染性克隆的产生；实验室安全计划ID：20145741；时间表G ID：12279）。这些研究是在美国政府针对涉及流感，MERS和SARS病毒的某些功能获得性研究的议事程序研究资助暂停之前启动的（http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function） .pdf）。本文已由美国国家卫生研究院（NIH）审核。要求继续进行这些研究，并且已获得NIH的批准。

SARS-CoV是选择代理。这些研究的所有工作均按批准的标准操作程序（SOP）和SARS-CoV，MERs-CoV和其他相关CoV的安全性条件进行。我们的机构CoV BSL3设施的设计符合微生物和生物医学实验室生物安全（BMBL），美国卫生与公共服务部，公共卫生服务，疾病控制中心（CDC）推荐的安全要求。）和NIH。实验室安全计划已提交给UNC环境卫生与安全部（EHS）和CDC并已批准使用。进入设施需要电子卡进入。所有工人都经过EHS培训，可以安全使用电动净化空气呼吸器（PAPR），并在BSL3设施中建立适当的工作习惯，并制定了积极的医疗监视计划。我们的CoV BSL3设施包括冗余风扇，风扇的应急电源以及生物安全柜和冰柜，我们的设施可容纳SealSafe鼠标架。分类为BSL3药剂的材料包括SARS-CoV，bat CoV前体菌株，MERS-CoV和衍生自这些病原体的突变体。在BSL3设施中，感染性病毒的实验是在经过认证的II类生物安全柜（BSC）中进行的。所有工作人员都穿着磨砂膏，特卫强套装和围裙，PAPR和鞋套，并且双手戴上双手套。BSL3用户必须遵守由大学员工职业健康诊所（UEOHC）监控的医疗监视计划，其中包括年度体检，在BSL中工作期间，应进行年度流感疫苗接种并强制报告与CoV感染相关的任何症状3。所有BSL3用户都接受了暴露管理和报告协议方面的培训，准备进行自我检疫，并经过培训可以在紧急情况下安全地运送到当地传染病管理部门。EHS和UEOHC会报告和调查所有潜在的暴露事件，并同时向CDC和NIH提交报告。

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变更记录

2015年11月20日

在最初在线发布的这篇文章的版本中，作者省略了承认来自EcoHealth Alliance的USAID-EPT-PREDICT资金到Z.-LS的资金来源。本文的印刷，PDF和HTML版本的错误已得到纠正。。

参考文献

1. 1个

Ge，XY等。使用ACE2受体的蝙蝠SARS样冠状病毒的分离和鉴定。自然 503，535-538（2013）。

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